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針對(duì)第一個(gè)問(wèn)題，羅敏敏實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種基于AAV的表達(dá)系統(tǒng)，可以稀疏、高亮地標(biāo)記特定類型的神經(jīng)元。這一標(biāo)記系統(tǒng)由兩個(gè)AAV載體兩組成：
1）控制子（Controller），由TRE啟動(dòng)子與Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。Cre依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的FLPo編碼序列；
2）放大子（Amplifier），由TRE啟動(dòng)子和FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊組成。FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊中包含3’-5’反向的GFP-IRES-tTA編碼序列。
這兩個(gè)病毒需混合后進(jìn)行腦內(nèi)注射?；旌喜《厩秩旧窠?jīng)元后，若神經(jīng)元內(nèi)無(wú)Cre表達(dá)，則標(biāo)記不發(fā)生。當(dāng)病毒感染Cre陽(yáng)性神經(jīng)元后，控制子中的Cre依賴的轉(zhuǎn)錄元件會(huì)被翻轉(zhuǎn)。由于此時(shí)神經(jīng)元內(nèi)沒(méi)有tTA表達(dá)，TRE啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性低。在大多數(shù)被病毒侵染的Cre陽(yáng)性神經(jīng)元中FLPo表達(dá)量極低，無(wú)法觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。隨機(jī)的，在某些Cre陽(yáng)性神經(jīng)元中，F(xiàn)LPo表達(dá)量達(dá)到一定的水平，觸發(fā)放大子中FLP依賴的轉(zhuǎn)錄模塊的翻轉(zhuǎn)。
由于放大子同樣使用TRE啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄活性低，只有少量的GFP和tTA表達(dá)。此時(shí)，在極少量細(xì)胞內(nèi)tTA的表達(dá)量達(dá)到一定水平，足以結(jié)合TRE啟動(dòng)子并啟動(dòng)其后基因的轉(zhuǎn)錄，正反饋回路被觸發(fā)：細(xì)胞表達(dá)更多的FLPo對(duì)剩余的放大子組件進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，并使更多的GFP和tTA被表達(dá)出來(lái)，標(biāo)記強(qiáng)度得到增強(qiáng)
。
該系統(tǒng)的設(shè)計(jì)有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
1）由于標(biāo)記的觸發(fā)依賴于Cre，通過(guò)將該稀疏標(biāo)記系統(tǒng)與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)用，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞類型特異性的稀疏標(biāo)記；
2）通過(guò)調(diào)整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標(biāo)記的稀疏程度。
基于這一標(biāo)記系統(tǒng)，羅敏敏課題組與華中科技大學(xué)國(guó)家光電研究中心fMOST課題組合作，建立了“稀疏標(biāo)記-樣本包埋-fMOST成像-神經(jīng)元重構(gòu)-數(shù)據(jù)校準(zhǔn)-量化分析”的流水線，實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定高通量的全腦成像和圖像分析。借助這一流水線，研究人員在DAT-Cre小鼠中重構(gòu)了15個(gè)中腦多巴胺神經(jīng)元的完整形態(tài)。
通過(guò)單細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，研究人員能夠?qū)⒅貥?gòu)的多巴胺神經(jīng)元分為兩類：一類多巴胺神經(jīng)元只有單個(gè)投射目標(biāo)，軸突在終點(diǎn)處會(huì)形成密集的末端樹狀分支；另一類投射軸突分布比較廣泛，會(huì)有多個(gè)旁分支投向不同目標(biāo)，少有末端樹狀分支。
研究人員利用不同血清型的AAV病毒，進(jìn)一步拓展了稀疏標(biāo)記系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了投射特異性的神經(jīng)元稀疏標(biāo)記。利用此方法并結(jié)合fMOST成像，研究人員成功對(duì)皮層-紋狀體投射神經(jīng)元進(jìn)行特異性標(biāo)記和完整重構(gòu)。
組織透明化是近期成像領(lǐng)域?qū)矣型黄频募夹g(shù)。研究人員將稀疏標(biāo)記系統(tǒng)與組織透明結(jié)合，在PV-Cre和SOM-ires-Cre小鼠中特異性的標(biāo)記了兩類中間神經(jīng)元，制成腦片后用uDISCO方法進(jìn)行透明化處理。隨后在共聚焦顯微鏡下成像，并對(duì)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行了重構(gòu)。通過(guò)此方法，研究人員實(shí)現(xiàn)了中間神經(jīng)元的快速重構(gòu)，并且可以高效地對(duì)神經(jīng)元樹突的分支特征進(jìn)行量化分析。
該稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的另一大優(yōu)點(diǎn)是可拓展性高。最初版本的稀疏標(biāo)記系統(tǒng)中，研究人員利用了Cre和FLP這一對(duì)重組酶。通過(guò)引入新的重組酶，理論上可以構(gòu)建與Cre/FLP版本相正交的新版本稀疏標(biāo)記系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)在同一樣本內(nèi)對(duì)不同種類神經(jīng)元的多色標(biāo)記。為了驗(yàn)證此策略，研究人員引入了DreO和vCre這一對(duì)新的重組酶，構(gòu)建了DreO/vCre版本的稀疏標(biāo)記系統(tǒng)。利用Cre/FLP和DreO/vCre兩個(gè)版本的稀疏標(biāo)記系統(tǒng)，研究人員成功實(shí)現(xiàn)在同一鼠腦內(nèi)對(duì)兩群神經(jīng)元進(jìn)行雙色稀疏標(biāo)記。
相比于現(xiàn)有的稀疏標(biāo)記方法，羅敏敏課題組開發(fā)的這一稀疏標(biāo)記策略具有易使用、易拓展、效率高的特點(diǎn)。除了文章中展示的分子特異性或投射特異性標(biāo)記，理論上該系統(tǒng)也可以與光遺傳學(xué)分子、分子探針、CRISPR/Cas9元件等聯(lián)用，用于單細(xì)胞水平功能性研究。這一技術(shù)的開發(fā)將有助于將腦連接譜研究推向單細(xì)胞精度，并有希望幫助研究人員在單細(xì)胞精度下對(duì)正常及病理狀態(tài)的神經(jīng)元進(jìn)行研究。
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